作者：蔡为民（江苏医院病理科）王宏景，耿建祥，夏林，龙秀荣，王旭波，王志慧，梅静，赵雪（南京中医院病理科/江苏省HPV协作组）
来源：临床与实验病理学杂志
[摘要]目的：观察宫颈正常细胞、宫颈鳞状细胞癌和腺癌组织标本中人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）感染的基因型分布情况及临床意义。方法：采用PCR和基因芯片检测技术对例宫颈正常细胞、例宫颈鳞状细胞癌和82例宫颈腺癌组织标本进行23种HPV基因分型检测，并对受检者进行相关资料分析。结果：例宫颈细胞正常者检出HPV感染为例，HPV感染率为10.41%（/）；例宫颈鳞状细胞癌检出HPV感染者例，HPV感染率为90.68%（/）；82例宫颈腺癌检出HPV感染者59例，HPV感染率为71.95%（59/82）。结论：PCR与基因芯片检测技术可用于宫颈细胞和组织标本检测，一次可检测23种HPV基因型，对我国女性宫颈HPV感染的分子流行病学调查、宫颈鳞状细胞癌及腺癌的防治及其疫苗的研究具有十分重要的意义。
全球范围内HPV的感染率逐渐增加，宫颈癌的发病率也逐年上升，并呈现年轻化趋势，该现象在发展中国家尤为明显，HPV持续性感染可认为是宫颈癌变的信号［1，2］。因此，对宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasia，CIN）、HPV感染的处理是防治宫颈癌的关键。我国每年宫颈癌新发病例在13万以上，约3万女性死于宫颈癌。因此，详细了解我国女性宫颈正常细胞、宫颈鳞状细胞癌及宫颈腺癌的HPV感染率和基因型别的分布情况对宫颈癌的防治和疫苗的研发具有非常重要的意义。
1、材料与方法1.1一般资料
收集年1月～年12月医院体检中心体检的已婚女性宫颈细胞学检查正常的细胞标本例，体检者年龄23～56岁，平均41.84岁；收集年9月～年12月江苏医院、医院、医院、医院、医院、医院、医院、医院、医院、医院、医院确诊的例宫颈鳞状细胞癌和82例宫颈腺癌组织标本。宫颈鳞状细胞癌患者年龄28～87岁，平均50.24岁；宫颈腺癌患者年龄21～78岁，平均50.13岁。病理切片均由两位高年资主治以上医师按照WHO（）妇科肿瘤的组织学分类标准进行复阅。
1.2仪器与试剂
GeneAmpPCRSystem型基因扩增仪（新加坡PERKINELMER公司）；FYY-3型分子杂交仪（兴化市分析仪器厂）；EppendorfR型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；BHC-ⅡA2型生物安全柜（苏州市安泰空气技术公司）；－20℃冰箱（青岛海尔公司）。HPV基因分型检测试剂盒（深圳亚能生物公司）。显色液须新鲜配制，使用时按所需浓度加蒸馏水配制。
1.3方法
1.3.1标本的采集及保存
（1）细胞标本：采用窥阴器或阴道扩张器充分暴露宫颈，用棉拭子擦去宫颈口过多的分泌物，将采样宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转宫颈刷4～5圈，慢慢抽出，以获得足够的宫颈上皮细胞标本，后沿刷柄折痕处折断刷头，将宫颈刷头部放入洗脱管中，旋紧洗脱管盖，做好标本标识，保持采集管直立，放入－20℃冰箱保存待测。
（2）石蜡组织标本：先去除每例石蜡组织周边多余的石蜡，切4μm厚的切片3～5张。用专用的镊子轻轻夹取，放入小离心管中。在切第2例石蜡组织前，用次氯酸钠溶液擦拭刀片及镊子各3次。
1.3.2DNA提取
（1）细胞标本：将宫颈刷头充分漂洗后，把洗脱液全部转移至1.5ml离心管中，0r/min离心10min，弃去上清液，保留管底的细胞，加入裂解液50μl，充分振荡混匀；
（2）石蜡组织标本：将切下的石蜡组织片放入1.5ml离心管中，加入裂解液μl，充分振荡混匀，两种标本均在℃金属浴中加热10min，立即0r/min离心10min，取中间层DNA溶液待用。PCR扩增、杂交、孵育和显色按说明书进行规范操作。每份标本显色后根据杂交信号的有无来判断结果。
1.4统计学处理
宫颈正常细胞、宫颈鳞状细胞癌及腺癌组织中HPV感染率及HPV各型别的比例采用HPV分型统计软件（南京倍宁医疗器械公司提供）进行分析。对分析出来的相关数据，应用SPSS13.0软件进行统计学处理，百分率的比较采用χ2检验或确切概率法，显着性检验水准为α=0.01。
2、结果例宫颈细胞学正常的细胞样本中HPV阳性者例，其中一重感染96例，多重感染13例（二重感染11例，三重感染2例）；例宫颈鳞状细胞癌组织中HPV阳性者例，其中一重感染例，多重感染36例（二重感染31例，三重感染3例，四重感染1例，五重感染1例）；82例宫颈腺癌中HPV阳性者59例，其中一重感染24例，多重感染35例（二重感染15例，三重感染8例，四重感染5例，五重感染7例）。例宫颈细胞学正常的HPV阳性感染者检出不同型别数合计次（高危型90次）；例宫颈鳞状细胞癌HPV阳性患者检出不同型别数合计次（高危型次）；59例宫颈腺癌HPV阳性患者检出不同型别数合计次（高危型次）（表1）。本组宫颈细胞学正常者的HPV感染率与宫颈鳞状细胞癌、宫颈腺癌者相比差异有统计学意义（χ2=.93和.38，P均＜0.01）。
表1三组宫颈标本中HPV阳性感染者不同型别感染频率及百分比的比较［n(%)］
3、讨论HPV感染是宫颈癌的主要致病因素，目前已发现多种类型，根据HPV致病性的差异性，将其分为高危型和低危型两大类，其中感染生殖道黏膜有50多种类型，可引起人体产生不同疾病［1，3，4］。宫颈癌作为一种病因学明确的恶性肿瘤，通过早期筛查和早期发现，是可防可治的疾病。因此，宫颈癌筛查是目前宫颈癌防控的关键。本文采用PCR与基因芯片检测技术，以23种常见的HPV作为感染源，对宫颈正常细胞、宫颈鳞状细胞癌和腺癌组织标本进行基因检测，并对其感染基因谱分布情况进行总结和分析。
根据Munozetal的分类，19种HPV被认为有致癌性，包括16、18、26、31、33、34、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82。95%的宫颈癌由8种高危型HPV（16、18、31、33、45、52、58、35）所致，约70%的宫颈癌和癌前病变组织中可检测到HPV16和HPV18［1，5，6］。目前，高危型HPV分型检测结合细胞学检查在宫颈癌筛查中有着显着的优势，在临床上，HPV分型检测可有效地分流HPV阳性的高风险人群，并可预测受检者罹患宫颈癌的风险，以确定最合适的筛查间隔。
本组实验结果显示：
（1）例宫颈细胞正常患者一重感染率为9.17%（96/），多重感染率为1.24%（13/）；例宫颈鳞状细胞癌患者一重感染率为68.32%（/），多重感染率为22.36%（36/）；82例宫颈腺癌患者一重感染率为29.27%（24/82），多重感染率为42.68%（35/82）。提示宫颈细胞正常的患者和宫颈鳞状细胞癌患者均以一重HPV感染为主，多重感染为辅，而宫颈腺癌患者以多重感染为主，一重感染为辅，说明宫颈癌患者中一重感染类型较丰富，而多重感染呈出不断增加趋势，出现了较为少见的五重感染，值得我们分析和研究。
（2）宫颈鳞状细胞癌中一重（例）和多重（36例）感染数之比为3.06∶1，宫颈腺癌中一重（24例）和多重（35）感染数之比为0.69∶1；宫颈腺癌中多重感染者超过一重感染，宫颈腺癌中HPV感染多重化的趋势上升更明显，这种一重和多重感染比例的倒置现象，还有待于多中心大样本的宫颈腺癌HPV基因分型研究进一步验证。
（3）本组中，宫颈鳞状细胞癌组35～64岁者例，占全组的80.75%（/），而宫颈腺癌组35～64岁者63例，占全组的76.83%（63/82），由此可见，宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌35～64岁患者均占据患病人数的绝大多数。由此不难看出，对我国年龄35～64岁的妇女行宫颈癌及癌前病变的筛查意义重大［1，7-9］。若筛查措施均落实到位，就可保护76%以上的女性远离宫颈癌。
（4）流行病学调查资料显示，高危型HPV导致宫颈癌的几率约1%，低危型HPV导致宫颈癌的几率仅为0.1%，95%以上的宫颈癌是由高危型HPV感染引起的，其中HPV16是最主要的致病型别［5，8，10］。本实验显示，宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌均以HPV16和18型为主，少数患者感染了其他高危型HPV，在宫颈鳞状细胞癌和腺癌中检出低危型HPV如HPV6、11、42、43、81型，这些低危型HPV、均是与高危型HPV同时出现在混合感染中，本文暂未发现低危型HPV单独致癌的病例。
（5）1项38个国家包含例的大样本研究显示：宫颈癌石蜡标本中，HPVDNA阳性率达85%，其中最常见的依次为HPV16、18、31、33、35、45、52和58型，这8种型别占总阳性率的91%［11］。本组中宫颈鳞状细胞癌组HPVDNA阳性率达90.68%（/），宫颈腺癌组HPVDNA阳性率为71.95%（59/82），宫颈鳞状细胞癌组高于上述大样本研究HPVDNA的阳性率，而宫颈腺癌组低于大样本研究HPVDNA的阳性率，这可能与使用的HPV检测方法不同，或采用标本的种类和数量不同有关。本文HPV最常见的8种型别在宫颈鳞状细胞癌组依次为HPV16、18、33、31、58、59、45、52型，这8种型别占总出现频率的91.58%（/）；在宫颈腺癌组依次为HPV16、18、31、33、58、52、45、35和43型，这9种型别占总出现频率的96.99%（/）。二组比较前2位、第5位和7位HPV型别排序相同，其余排序不同，出现型别也有差异，宫颈鳞状细胞癌组出现了59型，而宫颈腺癌组出现了35和43型，本组宫颈鳞状细胞癌组和腺癌组与38个国家大样本研究资料比较也存在一定的差异性，这可能与HPV在宫颈鳞状细胞癌和腺癌组织中的感染存在着地域和种族的差异有关。
（6）目前，宫颈腺癌的致癌因素尚未阐明，但较为明确的因素有HPV感染和激素等［1，12］。一项汇总了（北美洲、中美洲、欧洲、亚洲、非州和大洋洲）38个国家的例宫颈癌HPV感染率的文献报道显示，其中例宫颈腺癌中HPV感染率为65.72%（/）［13］，而韩国和中国学者报道的宫颈腺癌中HPV感染率分别为89.63%（/）［14］和73.08%（57/78）［15］。本组宫颈腺癌HPV感染率（71.95%，59/82）高于宫颈正常细胞组（10.41%，/），差异有统计学意义（P＜0.01）。说明HPV感染与宫颈腺癌密切相关，也说明亚洲地区HPV感染率较全球平均水平高，提示HPV感染存在着地域和种族差异。
（7）本组实验显示宫颈鳞状细胞癌组35～64岁HPV阳性患者中，HPV16和18型出现率为73.37%（/），其他高危型HPV出现率为26.63%（49/）；宫颈腺癌组35～64岁HPV阳性患者中，HPV16和18型出现率为58.46%（76/），其他高危型HPV出现率为41.54%（54/），如果我国使用二价宫颈癌预防性疫苗可保护35～64岁宫颈鳞状细胞癌患者免受73.37%HPV16和18型的感染，宫颈腺癌患者免受58.46%HPV16和18型的感染。（8）由于HPV型别众多， 宫颈腺癌是宫颈癌的一种特殊病理类型，约占宫颈癌的5%。近年来，宫颈腺癌发病率及其在宫颈癌中所占比例逐年上升，发病年龄呈年轻化趋势，对放、化疗的敏感性显着低于宫颈鳞状细胞癌。此外，宫颈腺癌比宫颈鳞状细胞癌具有更高的淋巴结转移率，其生存率比宫颈鳞状细胞癌显着降低。宫颈腺癌的发生也与HPV感染密切相关，研究其致癌机制可为临床诊治提供一种新思路。尤其要重视早期的诊断方法，包括改进取材和诊断技术等方面，采用更加合理的宫颈癌五阶梯筛查法，早期检出宫颈腺癌和鳞状细胞癌，这样宫颈癌将会成为人类第一个可进行有效预防的恶性肿瘤，造福于广大女性［1，5，16］。
参考文献：（略）
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