肿瘤标记物及分子诊断技术在甲状腺微小癌诊

中国实用外科杂志Vol.36(5):-

中图分类号：R6文献标志码：A

基金项目：福建省中青年卫生骨干人才科研项目（No.-ZQN-ZD-13）；福建省卫生计生委青年科研课题（No.-1-43）；国家卫生部临床重点专科建设项目；福建省临床重点专科建设项目

作者单位：福建医院

通信作者：赵文新

E-mail：Zhaowx

fjmu.edu.cn

摘要

细针穿刺活检（FNAB）是甲状腺微小癌（TMC）术前诊断的金标准。由于技术上的局限性，目前仍有25%～30%的病例通过FNAB不能明确病变性质。甲状腺癌的发生与基因密切相关，从分子生物学角度研究肿瘤标记物及分子诊断技术在TMC中的应用，有望弥补FNAB诊断的不足，提高TMC诊断的敏感度和特异度。同时，通过分子生物学分析，有助于指导术前的危险分层、判断预后，从而选择最佳的初次治疗方案。

关键词

分子检测技术；肿瘤标记物；甲状腺微小癌；细针穿刺活检

甲状腺微小癌（thyroidmicrocarcinoma，TMC）是指肿瘤直径≤1.0cm的甲状腺癌，近年来发病率在全球范围内呈上升趋势。尽管TMC的总体预后较好，但仍有约1.0%的病死率、5.0%的颈侧区淋巴结转移发生率以及2.5%的远处转移率。TMC的发生发展过程与基因密切相关，深入了解其相关分子标记物，有助于诊断、手术策略的制定及术后个体化治疗。本文就肿瘤分子标记物在TMC中的应用进行阐述。1分子标记物与TMC诊断

由于TMC体积小、发病隐匿、临床症状表现不明显、并常有与其他甲状腺疾病并存等特点，其术前诊断比较困难。根据年美国甲状腺协会（ATA）指南，对甲状腺结节的处理意见以细针穿刺活检（fine-needleaspirationbiopsy，FNAB）结果为依据，其诊断甲状腺结节良恶性的敏感度为65%～98%，特异度是72%～%。根据Bethesda分类系统，可以将细胞学检查结果分为6类，其中细胞学检查不能确定的结节占25%～30%。年版ATA指南建议对这部分病人进一步行分子标记物检测。一个理想的确定性诊断分子标记物须与组织学检查有类似的阳性预测值（98.6%）。而一个理想的排除性诊断分子标记物则须与细胞学检查有类似的阴性预测值（96.3%），这样可以保持合理的精度和可重复性。目前，甲状腺结节分子诊断标记物检测方法包括：基因突变和重排检测、基因表达分类谱（geneexpressionclassifier，GEC）和免疫组化染色。

1.1基因突变和重排

基因突变和重排的检测包括BRAF、N-ras、H-ras、K-ras基因突变，RET/PTC1、RET/PTC2、RET/PTC3、PAX8/PPARγ基因重排。BRAF基因突变类型，主要为11、15外显子上第位核苷酸T→A的转换，即密码子的突变（BRAFVE）。BRAFVE突变导致BRAF激酶持续激活，并使丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）下游传导分子高表达，从而导致细胞过度增殖、分化，最终导致甲状腺细胞的恶性转化。BRAF基因是甲状腺癌分子标记物研究最广泛的基因，用于肿瘤的诊断、危险分层及预后分析。Ras基因突变热点主要有H-Ras、K-Ras和N-Ras3种类型，多见于甲状腺滤泡癌（follicularthyroidcarcinoma，FTC），占FTC的40%～50%，占甲状腺乳头状癌（papillarythyroidcarcinoma，PTC）的10%。RET原癌基因的突变在PTC中主要表现为基因重排，RET/PTC重排是PTC中较常见的基因改变，占10%～40%。切尔诺贝利事故中射线的暴露造成儿童和青少年PTC例数增加，其中RET/PTC重排高达70%~80%。Pax8基因编码的转录因子，参与甲状腺滤泡细胞的分化和甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶及促甲状腺受体等组织特异性基因的表达，是正常甲状腺细胞生长和分化的重要调节因子。

在一项单中心研究中，BRAF基因突变对于可疑恶性的甲状腺结节，敏感度为36%，特异度为%。虽然BRAF基因检测具有较高的特异度，但其敏感度不足。因此，临床采用多个标记物联合检测以提高精确率，并设计了分子标记物面板，Asuragen（Austin，TX）miRinform甲状腺面板就是其中一个。分子标记物面板包括了BRAF、H-Ras、K-Ras、N-Ras、RET/PTC1、RET/PTC2、RET/PTC3、PAX8/PPARγ重排及其他重排融合基因。对于滤泡性肿瘤和可疑滤泡性肿瘤（FN/SFN结节），分子标记物面板检测的敏感度为57%～75%，特异度为97%～%，阳性预测值为87%～%，阴性预测值为79%～86%。但分子标记物面板检测结果阴性并不能完全排除甲状腺癌，因为有些FTC分子标记物检测均为阴性。ThyroSeqv2和Glioseq是第二代的基因检测面板，其基于单个碱基的插入与缺失以及基因重排融合。一项单中心研究采用ThyroSeqv2基因检测面板，检测例滤泡性肿瘤标本，敏感度为90%（95%CI80%～99%），特异度为93%（95%CI88%～98%），阳性预测值为83%（95%CI72%～95%），阴性预测值为96%（95%CI92%～%）。因此，多基因的联合检测可提高甲状腺癌诊断的敏感性与特异性。

1.2GEC

其他分子诊断方法也在不断出现，尤其是mRNA标记物和miRNAs（microRNAs）标记物用于FNAB不确定的甲状腺肿瘤的诊断。miRNAs是一类短序列、非编码的RNA，长19～25个碱基对，可作为基因表达的负调控因子。目前，有多种miRNAs在PTC中表达上调。miR-对应目标基因MET，miR--3p对应目标基因ITGAV，miR-对应目标基因ITGA3，miR-对应目标基因ITGA2，miR-对应目标基因KIT和AXIN2，miR-15a对应目标基因AXIN2和FOXO1，miR-对应目标基因KIT，结合对应目标基因的功能，进一步阐明miRNAs在PTC中的致癌作用。在此基础上，Veracyte开发的AfirmaGEC通过评价FNAB标本中个基因的表达以鉴别结节的良恶性，即GEC。在前瞻性多中心研究中，GEC对于甲状腺滤泡性肿瘤的诊断，具有较高的敏感度（92%）和低的特异度（48%～53%），其阴性预测值为94%（95%CI79%～99%），阳性预测值为37%（95%CI23%～52%）。虽然特异度较低，但其阴性的结果将恶性的风险从24%降至5%。因此，GEC检测结果阴性多用于甲状腺癌的排除诊断，使部分病人避免了外科手术治疗。

1.3免疫组化

半乳糖凝集素-3（Galectin-3）和人骨髓内皮细胞标记物（HBME-1）在PTC的诊断及鉴别FTC和滤泡性腺瘤中具有重要作用，Galectin-3在FTC和PTC中高表达，而在未分化癌或髓样癌中不表达或弱表达。HBME-1在肿瘤血管的形成、生长及转移等方面发挥重要作用。HBME-1在分化型甲状腺癌中高表达，在未分化癌和良性病变中为阴性或部分表达。Galectin-3和HBME-1具有相对较高的特异度，但也受到敏感度较低的限制，通过两者联合应用有助于提高敏感度。由于免疫组化检测费用较低，故在低收入地区Galectin-3免疫组化检测是一个可行的指标。

对于微小的甲状腺结节，在超声检查和FNAB不能明确诊断的情况下，参考分子标记物的检测结果有助于结节性质的诊断。目前，尚无单个最佳的分子标记物能确切地诊断或排除甲状腺癌，分子标记物用于细胞学检查不能确定的甲状腺结节诊断还须进行长期的临床研究。在临床应用中，分子标记物检测须在经过认证的分子实验室进行，以降低检验误差，同时须进行多基因联合检测以提高其诊断价值。

2分子标记物与甲癌复发危险分层

Tufano等对9个国家发表的14篇文献进行Meta分析，例PTC中BRAFVE突变比野生型BRAF具有更高的复发率（24.9%vs.12.6%），其对预测肿瘤复发的敏感度为65%，说明BRAFVE突变与肿瘤的复发密切相关。部分研究通过多因素分析发现BRAFVE突变是肿瘤复发的独立危险因素，但也有其他研究得出相反的结论。BRAFVE突变与侵袭性亚型、淋巴结转移和腺体外侵犯密切相关，故目前很难区分是BRAFVE突变还是临床病理特征导致的差异。鉴于此，BRAFVE突变尚不能作为预测病人危险分层的独立因素，但可以和其他临床病理因素联合用于肿瘤复发的危险分层，从而指导外科手术方案的制定。年版ATA指南中，低复发风险定义为，局限于腺体内的TMC，但未发生腺体外侵犯、血管浸润及淋巴结转移，无论是否合并BRAFVE突变；中度复发风险定义为，合并BRAFVE突变及甲状腺外侵犯的多灶性肿瘤。

另外两个与肿瘤的复发风险相关的基因为TP53和TERT。TP53突变可发生于分化型PTC（3.5%）、分化型FTC（11%）以及多数的低分化或未分化癌。分化型甲状腺癌中TP53突变均合并BRAF基因突变（或BRAF+PIK3C4），并有肺部转移或广泛的腺体外侵犯。TERT突变则发生于PTC（7%～22%）和未分化癌（14%～17%），而在失分化癌中的阳性率更高。在一项包括例PTC和70例FTC的研究中发现，在分化型甲状腺癌中，TERT基因突变是无病存活率（OR=4.68，95%CI1.54～14.27）、病死率（HR=10.35，95%CI2.01～53.24）独立的预测指标。TERT合并BRAF基因突变与病人的复发率密切相关，较单独使用BRAF基因预测具有更高的准确率。

可见，对于TMC早期治疗方案制定，可参考分子标记物的检测结果。基于上述分析可知，符合以下3种情况的肿瘤具有高侵袭性及复发风险，须制定更积极的治疗方案：

BRAFVE突变同时合并不良的临床病理特征。

TERT基因突变（单独或合并BRAF基因突变）。

TP53基因突变。

3分子标记物与甲状腺癌的靶向治疗

以往临床研究表明，BRAFVE突变的病人钠碘同向转运体（sodiumiodidesymporter，NIS）基因表达及碘摄取均明显减少，提示BRAF基因与病灶的摄碘活性密切相关。近期一项研究中，纳入TNM分期为T1aN0M0的例PTC病人，其中37例没有接受I治疗，97例接受I治疗，24.0%的病人BRAF基因突变，仅2.4%BRAF阳性的病人须接受I治疗。目前，分子标记物对决定甲状腺癌术后I治疗，还缺乏随机对照研究。

目前，许多靶向治疗药物正在进行临床实验，其中最值得期待的是BRAFVE特异性的抑制剂维莫非尼及ras特异性抑制剂替吡法尼。维莫非尼可抑制BRAFVE、C-Raf和野生型BRAF，目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准可用于治疗晚期（转移性）或不可切除的黑色素瘤。替吡法尼作用于H-ras或N-ras突变细胞，联合应用索拉非尼时可同时抑制B-Raf、ret、VEGF、H-ras、N-ras，从各靶点同时抑制Ras-Raf-MAPKkinase/ERK-ret信号传导通路。这两个药物均完成Ⅰ期临床试验，并展示出了临床效果。其他如淋巴瘤激酶（ALK）和神经营养性酪氨酸激酶3型受体（NTRK3）等参与甲状腺癌发病机制的新基因的发现，有望为临床提供新的、有效的治疗靶点。

4展望

TMC治疗基本目标是提高总体存活率和无病存活率，降低肿瘤残留或复发以及转移等伴随症状发病风险，并且精确进行疾病分期及危险分层，同时避免不必要的治疗。分子标记物在对TMC的治疗具有十分重要的意义。分子标记物联合检测对FNAB不能确诊的标本提高了诊断的准确率；特异性的分子标记物有助于揭示甲状腺癌的分期、危险分层及预后评估，为甲状腺癌的手术方式和范围提供了指导作用；同时，针对分子标记物在疾病发生过程中的作用，可以为基因的靶向治疗提供新的研究手段。

本文转载自「中国实用外科杂志」，转发已获授权。

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